前言

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在當今這個科研節(jié)奏飛快的時代，想要把科學論點高調地發(fā)表在頂級期刊上往往需要運用多種技術采集“立體而豐滿"的結果作為論據支持。以組織樣本為例，要實現單細胞分析，我們很容易會想到流式細胞術（Flow cytometry）。在此基礎上進行空間定位分析，免疫組化（Immunohistochemistry）的優(yōu)勢則非常明顯。而說到蛋白組學分析，質譜分析法（Mass spectrometry）無疑是最“接地氣"的手段。喜愛高效率的我們不禁會問：“有沒有一個技術能綜合單細胞、空間定位和蛋白組學分析的優(yōu)點呢？" 這時，徠卡人會自豪地告訴你：“Cell DIVETM了解一下~" 接下來，讓我們結合實際應用，看看Cell DIVETM在單細胞、空間定位和蛋白組學分析方面的優(yōu)勢。
 

小鼠腸道簇狀細胞單細胞分析

通過成像手段實現單細胞分析的最大難點在于如何實現單一樣本的多色標記。傳統(tǒng)熒光免疫組化技術受到熒光染料光學特征的限制，難以完成一個樣本內超過7種生物標志分子的成像任務。Cell DIVETM技術通過多輪染色的手段克服了該難題，可以在一個樣本內實現多于60種生物標志物的成像檢測。配合病理分析軟件，可以輕松地完成每個細胞內各種生物標志分子的半定量分析。

下面這篇文章就是我們美國范德比爾特大學醫(yī)學中心（Vanderbilt University Medical Center）的客戶用Cell DIVETM完成的小鼠小腸簇狀細胞（Tuft cells）14種生物標志物的成像和異質性分析[1]。簇狀細胞，也叫做多吞飲小管細胞 （Caveolated cells），是一種分布于胃腸道的罕見細胞類型，約占所有腸上皮細胞的0.4%，其頂端呈現密集的微絲結構，并在化學傳感（Chemosensing）中發(fā)揮作用。

作者通過功能性蛋白檢測不僅發(fā)現了小腸簇狀細胞的數量、組成和功能受飲食和腸道菌群調控的規(guī)律，還發(fā)現了Hopx和p-EGFR高表達的兩個新簇狀細胞亞群，為腸道簇狀細胞的進一步研究提供了基礎框架。在本研究中，Cell DIVETM發(fā)揮了強大的單細胞分析能力，幫助作者完成簇狀細胞的精確定位和功能性分子表達量分析（圖2）。

圖2 小鼠簇狀細胞（Tuft cells）超多標成像-分析圖 [1] 

（1A）細胞圈選分割示意圖，（2A & B）細胞群體t-SNE分析及簇狀細胞異質性分析，（3）簇狀細胞功能性分子熒光成像圖。

腫瘤-免疫細胞空間定位分析

分子空間定位信息的呈現是顯微成像技術的傳統(tǒng)優(yōu)勢，但難以對成像數據進行深度信息挖掘，導致圖像往往只能作為文章結論的“助攻"型結果。作為一套整體解決方案，Cell DIVETM結合了當今定量病理分析行業(yè)的金標準——HALO軟件（圖3），使圖像深層信息的呈現不再遙不可及。單細胞生物標志物定量、組織區(qū)域AI智能識別、細胞密度/浸潤/距離分析等HALO最擅長的分析方式能輕松解碼超多標圖像的隱藏信息。

圖3 HALO定量病理分析示意圖

接下來，我們通過一篇由美國梅奧診所（Mayo Clinic）的客戶發(fā)表的惡性黑色素瘤微環(huán)境研究的文章來看看Cell DIVETM強大的空間定位分析能力[2]。腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞和免疫細胞的相互作用關系對研究腫瘤免疫應答具有重要意義。

作者用Cell DIVETM技術對173例III期惡性黑色素瘤病人臨床樣本中21種生物標志分子進行成像（圖4），進而通過分析多個免疫細胞亞群的浸潤特征，找到決定異質性腫瘤微環(huán)境中淋巴細胞浸潤的關鍵因素——高表達HLA-1的腫瘤細胞。在本研究中，Cell DIVETM展現了優(yōu)秀的批量數據處理和空間定位分析能力，幫助作者完成不同HLA表達水平的腫瘤細胞與淋巴細胞的精準定位分析（圖4-6A）。

圖4 黑色素腫瘤微環(huán)境中免疫細胞空間定位分析圖 [2] 

（1B）腫瘤病人淋巴結分區(qū)視野選擇示意圖，熱圖顯示所選視野標記分子表達差異，（3A & B）腫瘤微環(huán)境中淋巴細胞浸潤密度分析，（6A）免疫細胞空間定位分析。

結腸癌MAPK信號通路蛋白組學分析

技術研發(fā)初期，Cell DIVETM之所以選擇多輪抗體標記路線的原因之一是為了突破單一樣品中檢測生物標志分子的數量限制。作為一種理論上沒有標記上限的實驗手段，多輪抗體標記法可以更好地滿足后續(xù)蛋白組學分析在標志分子數量上的需求。

為了更高效地進行實驗設計，Cell DIVETM研發(fā)團隊在技術研發(fā)的同時，進行了抗體庫的建立。目前，已經完成了350余種特異性抗體的Cell DIVETM技術兼容性測試。不僅如此，我們還根據多個領域內著名的生信數據庫（如KEGG PATHWAY等）將抗體按照不同研究方向進行歸類。用戶可以在抗體庫內根據自己感興趣的研究方向查找關鍵蛋白，極大地提高了實驗設計環(huán)節(jié)中抗體選擇的效率（圖5）。

圖5 腫瘤研究Cell DIVETM已驗證抗體數（部分）

Cell DIVETM研發(fā)時期的一篇文章向我們展現了上述的抗體資源庫在腫瘤病理分型方面具有優(yōu)勢[3]。為了優(yōu)化結直腸癌病理分型系統(tǒng)，作者利用抗體資源中的一系列生物標志物對747例I至III期結直腸癌樣本進行了Cell DIVETM單細胞空間蛋白組學分析。針對不同生理事件和關注的信號通路，作者選取了細胞應激、細胞外基質、調節(jié)蛋白和激酶等61種生物標志分子。

通過蛋白組學分析，作者發(fā)現mTORC1通路上游蛋白RPS6、4E-BP1和ERK1/2的磷酸化程度有望作為判斷結直腸癌病人雷帕霉素耐藥的關鍵指標（圖6）。這里不得不表揚一下Cell DIVETM抗體測試團隊，完成了大量的抗體驗證工作，幫助Cell DIVETM用戶在實驗設計環(huán)節(jié)節(jié)約了不少抗體信息檢索的時間。

圖6 結直腸癌Cell DIVETM檢測和蛋白組學分析 [3] 

結語

作為一套整體解決方案，Cell DIVETM涵蓋了從實驗設計到圖像采集再到結果分析的全套標準化操作流程、優(yōu)秀的成像設備和強大的數據解析系統(tǒng)，幫助用戶輕松實現超多標（>10種標記分子）成像，解鎖單細胞空間蛋白組學分析技能。

圖7 Cell DIVETM 超多標組織成像分析整體解決方案

參考文獻：

[1] Eliot McKinley, et al. Optimized multiplex immunofluorescence single-cell analysis reveals tuft cell heterogeneity. JCI Insight. 2017, 2(11): e93487

[2] Yan Yiyi, et al. Understanding heterogeneous tumor microenvironment in metastatic melanoma. PLoS ONE. 2019, 14(6): e0216485

[3] Gerdes MJ, et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. PNAS, 2013, 110(29): 11982–11987