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如何使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞

點(diǎn)擊次數(shù):2271 更新時(shí)間:2022-06-08

免疫熒光
IF是一種通過(guò)熒光基團(tuán)標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)有機(jī)分子,胞內(nèi)定位及其相互作用關(guān)系的成像研究手段。IF制劑可通過(guò)多種顯微鏡技術(shù)(如激光共聚焦、寬場(chǎng)熒光、全內(nèi)反射成像等)來(lái)加以分析,具體取決于應(yīng)用目的或研究人員的關(guān)注重點(diǎn)。與此同時(shí),在很多使用至少一套簡(jiǎn)易熒光顯微鏡的研究工作組當(dāng)中,IF早已成為*的一部分。
IF實(shí)驗(yàn)的核心部分是兩種不同組分的組合:

  • 首先是特異性抗體,用于形成免疫復(fù)合物來(lái)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)需要研究的分子,大多數(shù)情況下為蛋白質(zhì)。

  • 其次是熒光色素,與免疫復(fù)合物耦合,可以利用顯微鏡進(jìn)行觀察目標(biāo)結(jié)構(gòu)。

 

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圖1:圖中顯示了間接免疫熒光的典型工作流程,上皮細(xì)胞粘附在蓋玻片上生長(zhǎng)。培養(yǎng)后細(xì)胞被固定,因此用化學(xué)交聯(lián)劑(如甲醛)將其殺死。再用清潔劑進(jìn)行透化處理,使抗體穿過(guò)細(xì)胞膜。用正常血清、奶粉或牛血清白蛋白來(lái)進(jìn)行封閉,可減少抗體與非靶向結(jié)構(gòu)的非特異性結(jié)合,從而減少假陽(yáng)性信號(hào)。接下來(lái)與一抗進(jìn)行孵育,特異性識(shí)別靶向分子上的表位。在第二個(gè)培育步驟中,應(yīng)用熒光耦合二抗,與一抗結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向結(jié)構(gòu)的可視化觀察。抗體孵育后,用DAPI或Hoechst等嵌入DNA的染料進(jìn)行細(xì)胞核染色。在顯微鏡載玻片上涂有封固介質(zhì)(例如Mowiol或Prolong Gold)的蓋玻片后,IF即已準(zhǔn)備好進(jìn)行顯微鏡觀察。

直接與間接免疫熒光
根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型的不同,有兩種不同的IF變體可以使用:第一種是直接IF或一級(jí)IF,一種具有特異性的一抗,能夠與熒光色素連接用于結(jié)合靶向結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)直接可視化觀察。
第二種變體是指間接或二級(jí)IF,這種變體需要采用兩步式培育。首先,特異性一抗識(shí)別靶向結(jié)構(gòu)。然后應(yīng)用與一抗特異結(jié)合的熒光色素耦合二抗。這種特異性是通過(guò)引導(dǎo)二抗抵御產(chǎn)生一抗的物種而獲得的(見(jiàn)‘抗體和熒光色素’章節(jié))。比較兩種IF變體可見(jiàn)兩者各有不同的優(yōu)缺點(diǎn):
通過(guò)耦合一抗和熒光色素,耗時(shí)的清洗和培育步驟被省略,所以直接IF比間接IF更快。因此,直接IF更易于處理,適合于在標(biāo)準(zhǔn)IF實(shí)驗(yàn)中(例如在臨床實(shí)踐中)對(duì)樣本進(jìn)行快速分析。但必須使用一種功能良好且對(duì)其抗原高度敏感的一抗。這同時(shí)也是一個(gè)缺點(diǎn),因?yàn)闊晒怦詈虾万?yàn)證的一抗成本較為高昂。此外,每個(gè)靶向結(jié)構(gòu)都需要一個(gè)單獨(dú)的一抗,與間接IF相比,抗體與直接IF中的熒光色素的連接限制了設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的靈活性。
這種靈活性是間接IF的顯著優(yōu)勢(shì)之一。通常在IF反應(yīng)過(guò)程中,同一樣本都會(huì)有幾個(gè)不同的靶結(jié)構(gòu)需要實(shí)現(xiàn)可視化觀察,因此必須為每個(gè)靶向分子選擇一個(gè)離散的熒光色素。
在間接IF中,不同的熒光耦合二抗可以與不同的一抗結(jié)合(當(dāng)然還要考慮到物種的反應(yīng)性)。相較之下,如果想在直接IF中對(duì)靶向結(jié)構(gòu)“玩"顏色組合,則需要為每一種顏色使用單獨(dú)的一抗。間接熒光的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是二抗的信號(hào)放大。多個(gè)二抗分子可與一個(gè)一抗結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng),這意味可減少使用一抗。
間接IF的工作流程可能需要花費(fèi)更多時(shí)間,但由于一抗和二抗能夠組合而且整個(gè)操作過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性更高,因此間接熒光成為了絕大多數(shù)研究人員的首要選擇方法。

 


圖片

圖2:有兩種方法通過(guò)免疫熒光顯示靶向結(jié)構(gòu):在兩種變體中,一種特異的一抗用于識(shí)別靶分子上的特定表位。在此圖中,目標(biāo)分子由幾個(gè)相同的蛋白質(zhì)亞單位(=大分子)組成,因此會(huì)在每個(gè)亞單位上表現(xiàn)出幾個(gè)相同類(lèi)型的表位。為方便簡(jiǎn)化,此處只描繪了一個(gè)表位。

直接IF中,一抗直接連接到熒光色素,在顯微鏡下觀察靶向結(jié)構(gòu)。間接IF中,熒光耦合二抗在第二培育步驟中使用,從而專(zhuān)門(mén)對(duì)一抗進(jìn)行標(biāo)記。因?yàn)槎鄠€(gè)二抗分子可以結(jié)合到一個(gè)一抗上,所以選擇抗體和熒光色素的靈活性更大,并能夠進(jìn)一步放大信號(hào)。

抗體與熒光色素

高質(zhì)量的IF染色當(dāng)中,最重要的工具是良好的一抗。同時(shí),幾乎每種細(xì)胞類(lèi)型中的每種蛋白質(zhì)都有一種或幾種市售抗體。但此處需要強(qiáng)調(diào)若干重要注意事項(xiàng)。
要根據(jù)IF染色來(lái)做出精確的科學(xué)或臨床聲明,就必須確保一抗對(duì)其目標(biāo)抗原的特異性。在操作中,研究人員不應(yīng)*依賴商業(yè)供應(yīng)商的說(shuō)明。應(yīng)根據(jù)之前的使用經(jīng)驗(yàn)以及文獻(xiàn)中確認(rèn)有效的一抗來(lái)進(jìn)行抗體選擇。查看制造商網(wǎng)站上的抗體數(shù)據(jù)表,查看IF染色的可用圖片并與自身期望相比較,或者與其他已發(fā)布的插圖進(jìn)行比較。注意抗體的克隆號(hào),因?yàn)閱慰寺】贵w只與一個(gè)表位特異性結(jié)合,而多克隆抗體可識(shí)別多個(gè)表位,因此有可能存在非靶向結(jié)構(gòu)的非特異性標(biāo)記。所以,特異性較高且性能較優(yōu)的單克隆抗體通常更昂貴,但也能獲得更好的效果。
如希望開(kāi)展多色間接IF實(shí)驗(yàn),則不同的一抗必須衍生自不同的物種,以便在之后通過(guò)熒光耦合二抗來(lái)區(qū)分免疫復(fù)合體(見(jiàn)表1)。比如,您希望使用小鼠衍生的抗體抗蛋白A、兔衍生的抗體抗蛋白B和大鼠衍生的抗體抗蛋白C來(lái)實(shí)施IF檢查。在選擇二抗時(shí)必須記住,每種抗體都只能特定識(shí)別一種一抗。此外,在這三種二抗的例子中,熒光色素的波長(zhǎng)光譜必須不同,以便在顯微鏡分析中辨別熒光信號(hào)。如今,可以買(mǎi)到與熒光色素相連的二抗,其波長(zhǎng)范圍從紫外線到紅外線,幾乎可以針對(duì)任何物種的一抗。因此,研究人員目前僅受到現(xiàn)有顯微鏡(濾光片組、激發(fā)激光器)配置的限制。利用新型的激光器,可以擴(kuò)展紅外一區(qū)的信號(hào)(圖一、二)。

靶向蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì) A

蛋白質(zhì) B

蛋白質(zhì) C

靶向物種

人類(lèi)

人類(lèi)

人類(lèi)

一抗

抗蛋白 A

抗蛋白 B

抗蛋白 C

一抗物種

反應(yīng)性

小鼠抗人

兔抗人

大鼠抗人

二抗物種

反應(yīng)性

羊抗小鼠

羊抗兔

羊抗大鼠

熒光色素

激發(fā)/發(fā)射

490/525 nm

556/573 nm

650/665 nm

表1:此處的多色間接IF示例演示了如何在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)標(biāo)記三種不同的蛋白質(zhì)。三種蛋白質(zhì)的一抗必須來(lái)自不同的物種,以便用三種不同的熒光色素耦合二抗來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。二抗的熒光色素必須在波長(zhǎng)光譜上有所區(qū)分才能在顯微鏡下進(jìn)行不同的分析。

 

圖片

圖一 常見(jiàn)熒光蛋白和熒光素的發(fā)射光譜

 


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圖二 在近紅外一區(qū),利用新型熒光標(biāo)記可以獲得更多信號(hào)。Cos-7細(xì)胞圖像,使用SiR-Actin(657 – 740nm探測(cè)范圍)、AF750-Tom20(760 – 790nm)、AF790-Tubulin(810 – 850nm)標(biāo)記。樣本由蘇黎世大學(xué)的Jana D?hner和Urs Ziegler提供。左:使用傳統(tǒng)的GaAsP探測(cè)器。右:使用STELLARIS 8。

了解了借助免疫熒光方法觀察細(xì)胞的原理,接下來(lái)獲得目標(biāo)樣本并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理制備用于熒光觀察的樣片。


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